Cheminiai zondai, žymenys ir biologiniai matavimai

Zondas susieja molekulinį klausimą su stebimu dydžiu

Cheminis zondas yra molekulė, naudojama biologiniam taikiniui ar procesui tirti. Fluorescencinis žymuo gali padėti nustatyti susijusios medžiagos vietą ar ją išmatuoti, o trikdantis zondas gali pakeisti taikinio aktyvumą. Matomam signalui ir biologiniam poveikiui reikia skirtingų įrodymų grandinių.

Svarbi cheminė tapatybė, reikšminga sąveika su taikiniu, patikrintas selektyvumas ir naudojimo kontekstas. Medžiaga, keičianti daugelio tyrimų rodmenis, taip pat gali trukdyti detektoriui, agreguotis ar veikti per kitus taikinius. Atrankoje gautas teigiamas radinys tampa informatyvus jį apibūdinus, o ne dėl jo pavadinimo.

Signalas gali keistis, kai taikinio kiekis nesikeičia

Nustatykite 5,000 žymens molekulių ir vidutiniškai 0.0600 absorbcijos įvykio vienam žymeniui per nurodytą matavimo langą. Tikėtinas sugertų fotonų skaičius yra 300. Kai fluorescencijos kvantinė išeiga 0.450, tikėtinas išspinduliuotų fotonų skaičius yra 135; surinkimo ir aptikimo tikimybė 0.0800 duoda tikėtiną aptiktų fluorescencijos įvykių skaičių 10.8. Pridėjus tikėtiną fono įvykių skaičių 3.20 gaunamas bendras tikėtinas įvykių skaičius 14.0.

Tai tikėtinosios vertės, todėl realizuotas skaičius neprivalo sutapti su trupmenine tikėtinąja verte 10.8. Absorbcijos įvykiai, fluorescencijos kvantinė išeiga ir surinkimas bei aptikimas yra atskiri veiksniai. Pakeitus absorbcijos įvykius iki 0.0300, o išeigą iki 0.900 išlaikoma jų sandauga ir tikėtinas signalas, nekeičiant nustatyto žymenų skaičiaus.

Atskiram tiesiniam žymėjimo modeliui pasirinkite taikinio kiekį 90.0 fmol, žymėjimo dalį f=0.650, suderintą kalibravimo koeficientą k=2.80 AU vienam pažymėtam fmol ir foną b=36.2 AU. AU žymi sutartinius atsako vienetus šiame apibrėžtame kalibravime. Pažymėto taikinio yra 58.5 fmol; taikiniui specifinis atsakas yra 163.8 AU, o neapdorotas signalas S=200 AU.

Apverskite suderintą funkciją S=kfn+b ir gaukite n=(S−b)/(kf)=90.0 fmol. Sumažinus tik k perpus iki 1.40 AU vienam pažymėtam fmol neapdorotas signalas tampa 118.1 AU, o ne 100 AU, nes fonas išlieka. Nauja suderinta atvirkštinė funkcija vis tiek duoda 90.0 fmol. Modelis remiasi prielaida, kad jo žymėjimo dalis, fonas ir kalibravimas tinkami; savavališkas neapdorotas fluorescencijos rodmuo jų nesuteikia.

Fluorescencija priklauso ne vien nuo molekulių kiekio

Nurodytam emisijos procesui fluorescencijos kvantinė išeiga sieja išspinduliuotus fotonus su sugertais fotonais. Ji skiriasi nuo sugertos krintančių fotonų dalies ir nuo detektoriaus surinkimo efektyvumo. Todėl absorbcija, emisija ir surinkimas patenka į atskiras paprasto fotonų skaičiavimo modelio dalis.

Signalas taip pat priklauso nuo pažymėtos medžiagos kiekio, vietinės aplinkos, fotoblukimo, fono ir prietaiso nuostatų. Ryškesnis dažiklis ar didesnis neapdorotas signalas savaime neįrodo didesnio taikinio kiekio. Naudokite nurodytai matricai, intervalui ir matavimo sąlygoms tinkamą kalibravimą.

Kryžminis reaktyvumas ir kontrolės apriboja skirtingas alternatyvas

Kalibruotame tiesinio atsako modelyje nustatykite tikrąją taikinio koncentraciją 4.50 nmol L⁻¹ ir netaikinio koncentraciją 90.0 nmol L⁻¹. Normuokite taikinio koeficientą iki vieneto ir nustatykite jo atžvilgiu santykinį netaikinio atsako koeficientą 0.0400. Tariamas taikinio ekvivalentu išreikštas signalas yra 4.50+0.0400×90.0=8.10 nmol L⁻¹; 3.60 nmol L⁻¹ šio ekvivalentinio signalo kyla iš netaikinio.

Netaikinis sudaro 3.60/8.10=0.444444444 modeliuojamo signalo. Padvigubinus tik netaikinio koncentraciją iki 180 nmol L⁻¹ gaunamas tariamas taikinio ekvivalentas 11.7 nmol L⁻¹ ir netaikinio signalo dalis 0.615384615, o tikrasis taikinys lieka 4.50. Didesnis atsakas neįrodo didesnio tikrojo taikinio kiekio.

Atskirame sintetiniame kontroliniame palyginime, kai taikinys yra, nešiklio, zondo A, kitokio zondo B ir neaktyvaus analogo rodmenys yra 105/72/77/100 AU. Kai taikinio nėra, rodmenys yra 104/101/104/102 AU. Kiekvieną kontrastą apibrėžkite kaip zondo ir nešiklio skirtumą esant taikiniui, atėmus zondo ir nešiklio skirtumą nesant taikinio.

Kontrastai yra −30 AU zondui A, −28 AU zondui B ir −3 AU neaktyviam analogui. Jie pagrindžia ribotą palyginimą tarp šių pateiktų fonų, negarantuodami sutampančių netaikinių profilių ar nepakitusios biologijos pašalinus taikinį. Duomenų apie imčių kintamumą ar neapibrėžties intervalą nepateikta.

Pakeitus tik A rodmenį nesant taikinio iš 101 į 70 AU, jo poveikis fone be taikinio tampa −34 AU, o kontrastas +1 AU. Dabar didelis tariamas poveikis pasireiškia ir be taikinio. Pradinė taikiniui specifinė interpretacija susilpnėja, nors A rodmuo esant taikiniui lieka 72 AU.

Atsakas gali apimti taikinio ir trukdžių indėlius

Matavimą galima vaizduoti atsako lygtimi su atskirais taikinio ir trukdžių nariais. Jei abu nežinomi, vienas išmatuotas skaičius gali derėti su daugeliu sudėčių. Atėmus tuščiojo mėginio rodmenį pašalinamas tik tas fonas, kurį jis iš tiesų atspindi.

Keli nepriklausomi atsakai gali padėti atskirti indėlius, kai jų koeficientai ir sąlygos žinomi bei pakankamai skirtingi. Matricos poveikis ar kryžminis reaktyvumas gali šiuos koeficientus keisti. Analizinio kalibravimo nuolydis skiriasi nuo klasifikatoriaus jautrio, kuris yra sąlyginė teigiamų priskyrimų dalis.

Kontrolės tikrina konkrečius alternatyvius paaiškinimus

Struktūriškai susijusi silpnai aktyvi kontrolinė medžiaga ir kitoks zondas, nukreiptas į tą patį taikinį, gali tikrinti skirtingus alternatyvius paaiškinimus. Palyginimai tik su detektoriumi arba be taikinio taip pat gali atskleisti trukdžius. Kiekviena kontrolė turi savus cheminius ir biologinius apribojimus.

Du skirtingi zondai negarantuoja, kad bus išvengta tų pačių poveikių netaikiniams, o neaktyvus analogas nebūtinai sutampa visomis kitomis savybėmis. Taikinio pašalinimas gali pakeisti likusią sistemą. Nuoseklios kontrolės sustiprina ribotą išvadą; jos savaime neįrodo viso mechanizmo ar taikymo.

Išnagrinėti pavyzdžiai

Pabandykite patys

1. Pakeiskite vidutinį absorbcijos įvykių skaičių iki 0.0300 ir kvantinę išeigą iki 0.900, nekeisdami žymenų, surinkimo ir fono. Raskite tikėtiną signalą; ar iš to išplaukia taikinio skaičiaus pokytis?

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   Aptikta fluorescencija 10.8 įvykio; iš viso 14.0 įvykio. Taikinio skaičiaus pokytis iš to neišplaukia.

   Absorbcijos ir išeigos sandauga lieka 0.0270 vienam žymeniui.

2. Sumažinkite tik k perpus iki 1.40 AU vienam pažymėtam fmol esant tam pačiam taikiniui, žymėjimo daliai ir fonui. Raskite neapdorotą atsaką ir taikinio kiekį.

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   Neapdorotas atsakas 118.1 AU; taikinys lieka 90.0 fmol.

   Specifinis atsakas sumažėja perpus iki 81.9 AU, o fonas lieka 36.2. Atvirkštiniam skaičiavimui naudokite naują kalibravimą.

3. Padvigubinkite netaikinį iki 180 nmol L⁻¹, išlaikydami pastovius tikrąjį taikinį ir koeficientą. Raskite tariamą taikinio ekvivalentu išreikštą signalą ir netaikinio dalį.

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   Tariamas ekvivalentas 11.7 nmol L⁻¹; netaikinio dalis 0.615384615; tikrasis taikinys lieka 4.50 nmol L⁻¹.

   Trukdantis narys yra 7.20 nmol L⁻¹ ekvivalento; didesnis bendras atsakas neįrodo taikinio augimo.

4. Pakeiskite tik zondo A rodmenį nesant taikinio iki 70 AU. Apskaičiuokite jo kontrastą ir interpretuokite taikiniui specifinį palyginimą.

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   Kontrastas +1 AU; pradinė taikiniui specifinė interpretacija susilpnėja.

   Pokytis fone be taikinio yra 70−104=−34 AU, o pokytis esant taikiniui lieka −33; dabar pasireiškia didelis poveikis be taikinio.

Ką verta įsidėmėti

• Sugertų fotonų, išspinduliuotų fotonų ir aptiktų įvykių vardikliai skirtingi.
• Kalibruotas signalas priklauso nuo žymėjimo, fono ir atsako prielaidų.
• Netaikinio gausa gali būti svarbi net tada, kai jo atsako koeficientas mažas.
• Kontrolės ir nepriklausomu principu veikiantys zondai savo ribose apriboja priežastines alternatyvas.