Jungimasis, atpažinimas ir struktūros bei funkcijos ryšiai

Jungimosi kontaktas neapibrėžia viso atpažinimo

Molekulinis atpažinimas apima sąveikas, palankias tam tikroms asociacijoms nurodytomis sąlygomis. Suderinamas grupių išsidėstymas gali padėti paaiškinti jungimosi hipotezę, tačiau vien brėžinys nesuteikia nei išmatuoto afiniteto, nei viso funkcinio atsako. Solvatacija, protonavimas, konformacijų populiacijos ir kiti partneriai gali paveikti asociaciją.

Pradėkite nuo hipotetinės reakcijos P+L ⇌ PL, kur viena baltymo vieta prisijungia vieną ligandą ir jokios kitos būsenos neįtrauktos. Pagal idealiosios koncentracijos susitarimą apibrėžkite K_d=c_P c_L/c_PL. Šis koncentracinis parametras turi koncentracijos vienetus. Šiame modelyje mažesnė vertė lemia didesnį prisijungimą esant tai pačiai palaikomai laisvojo ligando koncentracijai.

Tikroji molekulinė sistema gali turėti kelias vietas, konkuruojančius ligandus ar susietas konformacijas. Tai modelio pakeitimai, o ne detalės, kurių automatiškai galima nepaisyti vien todėl, kad kreivė atrodo įsotinama.

Baigtiniams bendriesiems kiekiams reikia baigtinio jungimosi balanso

Duokite išgalvotus dydžius: bendrą baltymo koncentraciją P_T=5.00 μmol L⁻¹, bendrą ligando koncentraciją L_T=6.00 μmol L⁻¹ ir K_d=2.00 μmol L⁻¹. Tegul x yra komplekso koncentracija. Iš balansų gaunamos laisvosios koncentracijos c_P=P_T−x ir c_L=L_T−x, todėl K_d=(P_T−x)(L_T−x)/x. Visos koncentracijos skaitinėje lygtyje išreiškiamos tuo pačiu vienetu.

Kai skaitinės koncentracijos išreiškiamos μmol L⁻¹, pertvarkius gaunama x²−13x+30=0. Jos šaknys yra 3 ir 10. Tik x=3.00 μmol L⁻¹ tenkina 0≤x≤min(P_T,L_T). Laisvojo baltymo yra 2.00, o laisvojo ligando 3.00 μmol L⁻¹; baltymo vietų užimtumas yra x/P_T=0.600.

Naudojant pažįstamą laisvojo ligando hiperbolę su L_T vietoj c_L, būtų gauta 6/(2+6)=0.750. Taip nepaisoma ligando išeikvojimo šioje baigtinėje atsargoje. Kvadratiniai palyginimo žymekliai grafike rodo būtent šią pakeitimo klaidą, o apskriti žymekliai ir brūkšninė linija išlaiko fizikinį kvadratinį balansą. Kai išeikvojimas nereikšmingas, galimas pagrįstas artinys; jis netampa teisingas vien pakeitus žymą „bendrasis“ į „laisvasis“.

Laisvieji rezervuarai lemia kitokį normavimą

Kitoje sutartoje pusiausvyroje tarkime, kad vienu metu tik vieną ligandą prisijungiančią vietą supa palaikomos laisvosios A ir B koncentracijos po 10.0 μmol L⁻¹. Priskirkite K_d,A=5.00 ir K_d,B=50.0 μmol L⁻¹. Vieta turi tris būsenas: neužimta, prisijungusi A arba prisijungusi B. Dvigubas užimtumas neleidžiamas.

Santykiniai svoriai yra 1, c_A/K_d,A=2.00 ir c_B/K_d,B=0.200. Padalijus iš jų sumos 3.20 gaunamos dalys: 0.3125 neužimtų, 0.6250 prisijungusių A ir 0.0625 prisijungusių B. Jų suma lygi vienetui. Esant šioms vienodoms palaikomoms laisvosioms koncentracijoms, prisijungusių A ir prisijungusių B santykis yra dešimt.

Laisvosios rezervuarų koncentracijos yra būtinos. Jei bendrieji A ir B kiekiai būtų baigtiniai ir išeikvojami, jų laisvosioms koncentracijoms reikėtų susietų balansų, o ne šio tiesioginio įstatymo. Skaičiavimas neaprašo nei negrįžtamo sugavimo, nei visuotinio biologinio specifiškumo; pakeitus partnerius ar sąlygas palyginimas gali pasikeisti.

Suderinamas standartines būsenas palyginkite naudodami bedimensį santykį

Idealiajam 1:1 susitarimui su bendra standartine koncentracija c° bedimensė asociacijos konstanta yra K_assoc°=c°/K_d. Standartinė jungimosi laisvoji energija yra ΔG_bind°=−RT ln K_assoc°=RT ln(K_d/c°). Pats dimensinis K_d tiesiogiai į logaritmą nededamas.

Lyginant A ir B pagal tą pačią standartinę būseną, c° susiprastina: ΔG_bind,A°−ΔG_bind,B°=RT ln(K_d,A/K_d,B). Naudokite priskirtas K_d vertes 5.00 ir 50.0 μmol L⁻¹ esant 298.15 K. Jų bedimensis santykis yra 0.100, todėl gaunama −5708.00950 J mol⁻¹, arba apie −5.708 kJ mol⁻¹.

Šis standartinis palyginimas daro A jungimąsi palankesnį suderinamame priskirtame modelyje. Tai nėra tikrasis laisvosios energijos pokytis ląstelėje, kinetinis barjeras ar funkcinio veiksmingumo skirtumas. Skirtingas susietas protonavimas, tirpiklis ar standartinės būsenos reikalautų aiškaus įvertinimo, o ne automatinio pateiktų skaičių lyginimo.

Disociacijos laikas nėra pusiausvyros konstanta

Imkite nepriklausomą hipotetinį pirmosios eilės disociacijos modelį be pakartotinio prisijungimo su k_off=0.0200 s⁻¹. Jei S(t) žymi po laiko t vis dar prisijungusią dalį, iš dS/dt=−k_off S ir S(0)=1 gaunama S(t)=exp(−k_off t). Vidutinė eksponentinio skirstinio buvimo trukmė yra τ=1/k_off, o pusperiodis t_½=ln 2/k_off.

Vidurkis yra 50.0 s, o pusperiodis 34.6573590 s. Po 100 s likusi prisijungusi dalis yra exp(−2)=0.135335283. Vidurkis ir pusperiodis skiriasi, nes aprašo skirtingas to paties eksponentinio skirstinio savybes. Nė vienas nereiškia, kad kiekvienas atskiras kompleksas disocijuoja būtent tuo laiku.

Pakartotinis prisijungimas ir papildomos būsenos gali pakeisti stebimą disociacijos kreivę. Vien priskirtas k_off nenustato pusiausvyros afiniteto; dar reikėtų asociacijos informacijos ir teisingos kinetinės schemos. Vien lėtas prisijungimo nykimas neįrodo ląstelinės funkcijos.

Asociaciją ir siūlomą funkciją tikrinkite atskirai

Struktūra gali pasiūlyti, kodėl partneris tinka ar kurios grupės dalyvauja atpažinime. Tada jungimosi matavimui reikia įrodymų apie molekulines tapatybes, aktyviąsias koncentracijas, sąlygas ir alternatyvas. Tvirtinimas prie paviršiaus, žymenys, daugiavalentiškumas ir kitos matavimo ypatybės gali pakeisti tariamojo jungimosi parametro reikšmę.

Funkcinis teiginys kelia papildomą klausimą: ar asociacija sukelia siūlomą atsaką tikroje sistemoje? Reikia tinkamų kontrolinių bandymų ir papildančių stebėjimų. Čia pateikti baigtinis balansas, tarpusavyje nesuderinamų būsenų normavimas, standartinio afiniteto palyginimas ir gyvavimo trukmės modelis be pakartotinio prisijungimo yra atskiros priemonės tiksliai kelti šį klausimą; jų išgalvoti skaičiai nėra biologinio veikimo matavimai.

Išnagrinėti pavyzdžiai

Pabandykite patys

1. Idealiajam jungimuisi santykiu 1:1 duota P_T=4.00, L_T=3.00 ir K_d=2.00 μmol L⁻¹. Raskite komplekso koncentraciją, laisvąjį ligandą ir baltymo užimtumą.

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   Komplekso 1.62771868, laisvojo ligando 1.37228132 μmol L⁻¹; užimtumas 0.406929669.

   Fizikinė šaknis yra (9−√33)/2, kai skaitinės koncentracijos išreiškiamos μmol L⁻¹. Hiperbolėje naudojant bendrąją ligando koncentraciją būtų klaidingai gauta 0.600.

2. Jungimosi vietą, kurioje vienu metu gali prisijungti tik vienas ligandas, supa palaikomos laisvosios koncentracijos A=5.00 ir B=25.0 μmol L⁻¹, o K_d,A=5.00 ir K_d,B=50.0 μmol L⁻¹. Raskite trijų būsenų dalis.

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   Neužimta 0.400, prisijungusi A 0.400 ir prisijungusi B 0.200.

   Svorius 1, 1 ir 0.500 normuokite dalydami iš 2.50. Baigtiniams bendriesiems kiekiams reikėtų kitokio susieto balanso.

3. Esant 298.15 K pagal tą pačią suderinamą standartinę būseną pakeiskite K_d,A į 20.0, o K_d,B į 5.00 μmol L⁻¹. Raskite ΔG_bind,A°−ΔG_bind,B° ir nurodykite palankesnį standartinį jungimąsi.

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   +3436.56415 J mol⁻¹; B standartinis jungimasis palankesnis.

   RT ln(20/5) yra teigiamas. Mažesnis K_d,B šiame modelyje reiškia labiau neigiamą standartinę jungimosi laisvąją energiją.

4. Pirmosios eilės k_off=0.0400 s⁻¹ be pakartotinio prisijungimo atveju raskite vidutinę buvimo trukmę, pusperiodį ir prisijungusios dalies išlikimą po 25.0 s.

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   Vidurkis 25.0 s; pusperiodis 17.3286795 s; išlikimas exp(−1)=0.367879441.

   Naudokite tris skirtingas apibrėžtis. Vien disociacijos greitis nenustato pusiausvyros afiniteto ar biologinio atsako.

Ką verta įsidėmėti

• Laisvojo ligando koncentracija ir baigtinis bendras ligando kiekis nėra tarpusavyje pakeičiami.
• Atmeskite šaknis, pažeidžiančias tikrąsias atsargas.
• Tarpusavyje nesuderinamų būsenų dalims reikia nurodytų laisvųjų rezervuarų.
• Standartiniams afinitetams lyginti reikia suderinamų standartinių būsenų ir bedimensių santykių.
• Buvimo trukmė, pusperiodis, pusiausvyros afinitetas ir funkcija atsako į skirtingus klausimus.