Fermentinė katalizė, kinetika ir slopinimas

Fermentas pakeičia reakcijos kelią ir spartą

Fermentai yra biologiniai makromolekuliniai katalizatoriai. Dauguma jų yra baltymai; jiems priskiriamos ir katalizinės RNR molekulės. Katalizė gali suteikti alternatyvų reakcijos kelią su kitokiais aktyvacijos barjerais ir paspartinti artėjimą prie pusiausvyros, nepakeisdama tos reakcijos pusiausvyros tomis pačiomis sąlygomis.

Substrato tapatybė, fermento būsena ir sąlygos priklauso spartos aprašymui. Po ciklo gali reikėti atkurti aktyviąją fermento būseną; katalizinė apyvarta nepateisina teiginio, kad kiekvienas fermentas kiekvienoje išimtinėje reakcijoje lieka chemiškai nepakitęs.

Termodinamiškai palankus virsmas gali išlikti lėtas. Ir atvirkščiai, greitas katalizinis kelias nepaverčia nepalankaus suminės reakcijos virsmo termodinamiškai palankiu. Susietiems procesams ir palaikomiems rezervuarams reikia išsamesnės reakcijų apskaitos.

Greičio lygtis apibrėžia savo parametrus ir sąlygas

Išgalvotam vieno substrato pradinės spartos modeliui naudokite v=VS/(K_m+S), kur S – laisvo substrato koncentracija, o V – ribinė sparta esant nurodytam aktyvaus fermento kiekiui ir pastovioms sąlygoms. Numatykite tinkamą kvazistacionarią sritį, nereikšmingą produkto kiekį, tiekiamą substrato rezervuarą ir nekintantį tyrimo tūrį. Tai nėra pradinis pereinamasis procesas ar visas ląstelės reakcijų kelio modelis.

Priskirkite V=12.0 μmol min⁻¹ ir K_m=2.00 mmol L⁻¹. Kai S=0.200, 2.00 ir 20.0 mmol L⁻¹, spartos atitinkamai yra 1.09090909, 6.00 ir 10.9090909 μmol min⁻¹. Kai S=K_m, lygtis duoda pusę ribinės spartos. Esant baigtiniam teigiamam S, neslopinama sparta yra mažesnė už V.

Šiame pavyzdyje priskirkite aktyvaus fermento kiekį 0.200 μmol ir vieną katalizinį centrą kiekvienai aktyvaus fermento dalelei. Tuomet k_cat=V/n_active=60.0 min⁻¹=1.00 s⁻¹. Kiekio ir laiko santykis, padalytas iš aktyvaus kiekio, yra pirmosios eilės apyvartos dydis. Bendroji preparato baltymų masė savaime nenusakytų šio aktyviųjų vietų kiekio.

K_m turi koncentracijos vienetus ir priklauso nurodytai Michaelis–Menten funkcijai. Bendruoju atveju jis nėra pusiausvirojo jungimosi K_d. Prisotinimo kreivė gali būti suderinama su keliais mechanizmais; elementariosioms stadijoms identifikuoti reikia papildomų įrodymų.

Konkurencinio slopinimo spartos pobūdis gali išlaikyti ribinę spartą

Naudokite operacinį konkurencinį modelį v=VS/(αK_m+S), kur α=1+I/K_ic, o I – palaikoma laisvo inhibitoriaus koncentracija. Priskirkite I=6.00 μmol L⁻¹ ir K_ic=3.00 μmol L⁻¹, todėl α=3.00. Inhibitoriaus santykis yra bedimensis, nors substratas ir inhibitorius išreikšti skirtingais koncentracijos masteliais.

Esant ankstesniems V ir K_m, tariamasis K_m tampa 6.00 mmol L⁻¹, o V lieka 12.0 μmol min⁻¹. Kai S=2.00 mmol L⁻¹, v=12×2/(6+2)=3.00 μmol min⁻¹.

Kai S=20.0 mmol L⁻¹, slopinama sparta yra 9.23076923 ir vis dar mažesnė už neslopinamą 10.9090909 μmol min⁻¹. Bendra asimptotė esant didelei substrato koncentracijai nereiškia, kad baigtinėje koncentracijoje slopinimo visiškai nėra. Operacinis pobūdis vienas neįrodo vienintelės fizinės jungimosi vietos, o dėl stipraus jungimosi vykstančiam laisvo inhibitoriaus išeikvojimui reikėtų kito modelio.

Mišrusis slopinimas pakeičia du tariamuosius parametrus

Numatykite v=VS/(αK_m+α′S). Pertvarkius gaunama tariamoji ribinė sparta V_app=V/α′ ir tariamasis K_m,app=αK_m/α′. Priskirkite α=3.00 ir α′=2.00. Tuomet V_app=6.00 μmol min⁻¹, K_m,app=3.00 mmol L⁻¹, o sparta, kai S=2.00 mmol L⁻¹, yra 2.40 μmol min⁻¹.

Specialiuoju grynojo nekonkurencinio slopinimo atveju α=α′=3.00, V_app=4.00, o K_m,app lieka 2.00. Numatytu bekonkurencinio slopinimo atveju α=1, α′=3.00, V_app=4.00 ir K_m,app=0.6666667 mmol L⁻¹. Šios skirtingos parametrų poros gaunamos iš apibrėžtos funkcijos.

Terminas „nekonkurencinis“ buvo vartojamas nenuosekliai, todėl nurodykite konkretų atvejį ir greičio lygtį. Kelių substratų sistemose operacinis klasifikavimas taip pat gali priklausyti nuo to, kurio substrato kiekis keičiamas, ir nuo kitų substratų sąlygų. Nė viena iš šių priskirtų funkcijų savaime nenustato jungimosi grupių vietos ar vietų skaičiaus.

Paspartėjęs pusiausvyros pasiekimas gali palikti tokią pačią galutinę sudėtį

Panagrinėkite atskirą uždarą idealų pirmosios eilės supaprastintą A ⇌ B modelį su tiesioginės reakcijos greičio koeficientu k_f=0.400 min⁻¹, atvirkštinės k_r=0.100 min⁻¹, bendra koncentracija 10.0 mmol L⁻¹ ir pradiniu B=0. A ir B taikykite tą patį standartinės būsenos susitarimą. Pusiausvyroje k_f c_A=k_r c_B, todėl c_B/c_A=4, o pusiausvirosios A/B koncentracijos yra 2.00/8.00 mmol L⁻¹.

Laiko ryšys yra c_B(t)=8.00[1−exp(−0.500t)] mmol L⁻¹, kai skaitinė t vertė pateikta minutėmis. Kai t=2.00 min, c_B=5.05696447 mmol L⁻¹. Numatytas katalizinis pakeitimas, padauginantis abu koeficientus iš dešimties, tą pačią sudėtį pasiekia per 0.200 min, išlaikydamas tą patį pusiausvyros santykį keturi.

Padauginus tik tiesioginės reakcijos koeficientą iš dešimties, santykis taptų keturiasdešimt ir pusiausvyra būtų kitokia; tai neatitiktų to paties paprasto katalizinio mastelio pakeitimo, kai termodinaminės sąlygos nekinta. Supaprastintas modelis neapima medžiagos surišimo su fermentu ir išorinės energijos įėjimo. Jis atskiria spartos informaciją nuo pusiausvyros, neteigdamas, kad modeliuoja tikrą fermentą.

Vietinis tyrimas nenustato visos sistemos srauto

Pradinės spartos tyrimas gali apibūdinti operacinį atsaką pagal nurodytas substrato, produkto ir fermento sąlygas. Biologiniame tinkle taip pat vyksta pernaša, konkuruojančios reakcijos, telkinių kitimas ir reguliacinės sąveikos. Todėl pusinio atsako koncentracija ar katalizinė apyvarta savaime neidentifikuoja visą tinklą valdančios stadijos.

Matematinį modelį naudokite tik jo nurodytomis sąlygomis, patikrinkite aktyviųjų katalizinių centrų kiekį ir atskirkite išmatuotus dydžius nuo priskirtų mokomųjų įvesties duomenų. Čia pateiktos originalios kreivės yra apskaičiuoti spartų modeliai, o ne fermentų duomenys ar ląstelių veikimo matavimai.

Išnagrinėti pavyzdžiai

Pabandykite patys

1. Padvigubinkite aktyvaus fermento kiekį tomis pačiomis sąlygomis ir palaikydami substrato koncentraciją. Raskite ribinį V, K_m ir spartas esant trims nurodytoms S vertėms.

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   V=24.0 μmol min⁻¹; K_m=2.00 mmol L⁻¹; spartos 2.18181818, 12.0 ir 21.8181818 μmol min⁻¹.

   Priskirtame modelyje V proporcingas aktyviesiems centrams; k_cat ir substrato pusinio atsako koncentracija nepakinta.

2. Kai S=20.0 mmol L⁻¹, palyginkite konkurencinio α=3 modelio spartą su neslopinama sparta. Ar slopinimas visiškai išnykęs?

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   9.23076923, palyginti su 10.9090909 μmol min⁻¹; esant šiai baigtinei S vertei slopinimas išlieka.

   Naudokite abu vardiklius. Vienodos ribinės asimptotės nereiškia vienodų spartų esant baigtinėms koncentracijoms.

3. Pateikite V_app, K_m,app ir spartą, kai S=2.00, grynajam nekonkurenciniam α=α′=3 ir bekonkurenciniam α=1, α′=3 slopinimui.

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   Grynasis nekonkurencinis: 4.00 μmol min⁻¹, 2.00 mmol L⁻¹, sparta 2.00. Bekonkurencinis: 4.00, 0.6666667, sparta 3.00 atitinkamais vienetais.

   Įstatykite į V_app=V/α′ ir K_m,app=αK_m/α′, tada patikrinkite pagal pradinį vardiklį.

4. Padauginkite abu A⇌B greičio koeficientus iš dešimties. Raskite pusiausvirąjį B ir laiką iki ankstesnės dviejų minučių sudėties. Ar pakeitus tik k_f išliktų K?

   Rodyti atsakymą ir paaiškinimą

   Pusiausvirasis B lieka 8.00 mmol L⁻¹; ta pati sudėtis pasiekiama per 0.200 min. Pakeitus tik k_f, santykis tampa keturiasdešimt.

   Bendras mastelio pakeitimas išlaiko k_f/k_r, bet paspartina relaksaciją. Vienpusis koeficiento pakeitimas yra kitas modelis.

Ką verta įsidėmėti

• Kai termodinaminės sąlygos nekinta, katalizatorius pakeičia artėjimą prie pusiausvyros.
• Ribinė sparta ir aktyviųjų centrų kiekis apibrėžia priskirtą apyvartą.
• K_m bendruoju atveju nėra jungimosi disociacijos konstanta.
• Nurodykite operacinę slopinimo lygtį ir substrato sąlygas.
• Vietinis spartos modelis neįrodo tinklo valdymo.