Chemija · Pamoka

Chromatografijos principai ir smailių interpretavimas

Sulaikymą, plotį, aukštį ir plotą vertinkite kaip skirtingus stebimus dydžius. Apskaičiuokite skiriamąją gebą pagal deklaruotą pločio susitarimą ir atpažinkite, kada tariamai viena smailė lieka nevienareikšmė.

Grįžti į chemijos planą

Baigę pamoką, galėsite

Apskaičiuoti sulaikymo faktorių pagal tinkamą nesulaikomos medžiagos atskaitą.
Skiriamajai gebai apskaičiuoti naudoti abiejų smailių pločius.
Susieti Gauso smailės aukštį ir plotą pagal aiškų atsako kalibravimą.
Parodyti, kodėl tikslus koeliuavimas gali paslėpti skirtingus komponentų kiekius.

Chromatograma registruoja atsaką laiko atžvilgiu

Kolonėlinėje chromatografijoje komponentai juda su judriąja faze, sąveikaudami su nejudriąja faze. Pasikartojantys mainai ar kitos sulaikymo sąveikos juos uždelsia skirtingai. Difuzija, baigtinis mainų greitis ir srauto skirtumai gali praplatinti juostas. Detektorius registruoja atsaką, kai šios juostos jį pasiekia; atsako jautrumas visiems komponentams nebūtinai vienodas.

Todėl chromatograma yra bendras atskyrimo ir aptikimo stebėjimas. Jos horizontalioji koordinatė gali būti praėjęs laikas, o vertikalioji – konkretaus detektoriaus atsakas. Sulaikymo trukmė, plotis, aukštis ir integruotas plotas apibūdina skirtingus požymius. Nė vienas atskirai nepateikia vienareikšmės molekulinės tapatybės ar visos sudėties.

Svarbi ir bazinė linija bei pasirinktos integravimo ribos. Matematinė Gauso smailė su nuline bazine linija naudinga mokymuisi, tačiau tikram slenkančiam fonui, neišskirtiems smailių pečiams ir asimetrinėms smailėms reikia papildomos interpretacijos ir patvirtinimo.

Nesulaikomos medžiagos atskaitą reikia pagrįsti

Apibrėžkite t_M kaip tinkamos patikrintos nesulaikomos etaloninės medžiagos pratekėjimo trukmę pagal tą patį laiko susitarimą. Pataisytoji sulaikymo trukmė yra t_R′=t_R−t_M, o sulaikymo faktorius k=t_R′/t_M. Pirmasis mėginyje aptiktas požymis automatiškai nėra tokia atskaita: jis gali būti sulaikomas, nepatekti į atitinkamą fazės tūrį ar būti paveiktas kitokio uždelsimo.

Originaliame pastovių sąlygų modelyje t_M=1.10 min ir t_R=5.50 min, o uždelsimas už kolonėlės ribų nereikšmingas arba pataisytas. Tada t_R′=4.40 min ir k=4.00. Neapdorotas santykis t_R/t_M=5.00 lygus 1+k; jis nėra k. Iš tikrųjų nesulaikomam komponentui pagal šį nustatytą atskaitos susitarimą t_R=t_M ir k=0.

Sulaikymo faktorius čia yra bedimensis chromatografinio uždelsimo santykis, o ne cheminės reakcijos greičio konstanta. Sulaikymas gali padėti palyginti su tinkamu etalonu, tačiau jis kinta priklausomai nuo metodo sąlygų ir nėra universalus cheminis atspaudas.

Skiriamoji geba lygina atskyrimą laike su abiem pločiais

Dviem smailėms A ir B, kai t_R,B>t_R,A, apibrėžkite skiriamąją gebą pagal bazės pločius R_s=2(t_R,B−t_R,A)/(w_b,A+w_b,B). Vardiklyje turi būti abu pločiai. Juos pakeičiant vien vėlesnės smailės pločiu reikia artinio, pavyzdžiui, kad pločiai pakankamai panašūs; jį reikia nurodyti.

Tikslioms Gauso smailėms w_b=4σ_t ir w_h=2√(2 ln 2)σ_t. Tada tą pačią skiriamąją gebą galima užrašyti R_s=√(2 ln 2)(t_R,B−t_R,A)/(w_h,A+w_h,B). Dažnai suapvalintas koeficientas 1.18 yra √(2 ln 2) artinys; tai nėra nauja tiksli tapatybė. Smailėms su uodega nepakanka vien Gauso pločio apibūdinimo.

Sukurkite 4.80 ir 5.40 min sulaikymo trukmes bei 0.400 ir 0.500 min liestinėmis nustatytus bazės pločius. Atskyrimas laike yra 0.600 min, o R_s=1.33333. Gauso smailių pločiai pusiniame aukštyje yra 0.23548 ir 0.29435 min; naudojant tikslų koeficientą jais atkuriamas tas pats rezultatas. Ši pasirinkta R_s vertė nepatvirtina tapatybės, grynumo ar visuotinai priimtino atskyrimo.

Vienodi plotai gali atsirasti esant nevienodiems aukščiams ir kiekiams

Tikslaus Gauso atsako R(t)=h exp[−(t−t_R)²/(2σ_t²)] su nuline bazine linija visas plotas yra hσ_t√(2π). Aukštis h turi atsako vienetus U; integruotas plotas turi U·min, kai laikas išreikštas minutėmis. Platesnė smailė gali būti žemesnė, išlaikydama tą patį plotą.

Simboliniam A suteikite 3.00 min vidurkį, σ_t=0.0800 min ir h=10.0 U; B suteikite 6.00 min vidurkį, σ_t=0.160 min ir h=5.00 U. Abu pilni matematiniai plotai yra 2.00530262 U·min. Jų aukščiai skiriasi dvigubai, o pločiai priešinga kryptimi taip pat skiriasi dvigubai. Grafike rodomos išgalvotos matematinės kreivės, o ne išmatuota chromatograma.

Dabar nustatykite žinomus tikslius tiesinius ploto ir atsako koeficientus su nuline sankirta: 2.00 U·min mmol⁻¹ komponentui A ir 4.00 U·min mmol⁻¹ komponentui B. Kiekis lygus plotui, padalytam iš to komponento koeficiento; gaunama 1.00265131 mmol A ir 0.501325655 mmol B. Todėl vienodi plotai nereiškia vienodų kiekių.

Rodomame intervale kreivės pateikiamos atskirais taškais; nurodyti plotai gaunami integruojant visą Gauso funkciją per visą laiką. Šie pateikti koeficientai neapima kalibravimo neapibrėžties, dreifo, matricos poveikių ir detektoriaus pokyčių. Tikram kiekio rezultatui reikia atitinkamo kalibruoto atsako ir tinkamo integravimo, užuot darius prielaidą apie vieną bendrą atsaką kiekvienai smailei.

Skirtingi aukščiai, vienodi pilni Gauso plotai

Atsakas / U

Laikas / min

A: 10.0 U; koeficientas 2.00 U·min mmol⁻¹
B: 5.00 U; koeficientas 4.00 U·min mmol⁻¹
— Dviejų sintetinių Gauso atsakų suma

Pradiniai duomenys

Laikas / min	Atsakas / U
3	10 · A: 10.0 U; koeficientas 2.00 U·min mmol⁻¹
6	5 · B: 5.00 U; koeficientas 4.00 U·min mmol⁻¹

Išgalvota Gauso smailė A su nuline bazine linija: vidurkis 3.00 min, σ_t=0.0800 min, aukštis 10.0 U; B: vidurkis 6.00 min, σ_t=0.160 min, aukštis 5.00 U. Brūkšninė linija yra jų atsakų suma. Apskritimas ir kvadratas žymi du priskirtus aukščius. Abu pilni analiziniai plotai yra 2.00530262 U·min; pavaizduotas intervalas yra taškais pateiktas vaizdas, o ne integravimo sritis. Ploto ir atsako koeficientai skiriasi, todėl išvesti kiekiai skiriasi.

Viena smailės forma gali slėpti du komponentų kiekių derinius

Apsvarstykite kitą originalų modelį su dviem žinomais mokomaisiais komponentais, kurie tiksliai koeliuoja. Jų bendra forma yra g(t)=exp[−(t−3.00 min)²/(2(0.100 min)²)], kurios didžiausia vertė lygi vienetui. Priskirkite smailės aukščio atsako koeficientus 2.00 U mmol⁻¹ komponentui A ir 3.00 U mmol⁻¹ komponentui B. Visas signalas yra R(t)=(2n_A+3n_B)g(t), kai kiekiai išreikšti mmol.

Kiekių derinys n_A=2.00 mmol ir n_B=2.00 mmol duoda koeficientą 10.0 U. Derinys n_A=5.00 mmol ir n_B=0 duoda tą patį koeficientą, ir kiekvienu laiko tašku signalas vienodas. Tankesnis tos pačios bendros formos registravimas nepateikia antro nepriklausomo kiekių ryšio.

Neatskiriamas signalas yra nurodyto modelio pasekmė, o ne teiginys apie kiekvieną detektorių. Papildomas selektyvus atsakas, pakeistas atskyrimas ar kiti nepriklausomi duomenys galėtų atskirti komponentų kiekių derinius. Vien simetriška pavienė smailė nepatvirtina gryno komponento.

Smailes interpretuokite pagal analitinį klausimą

Sulaikymo atitiktis, siaura juosta ir švariai atrodanti bazinė linija gali suteikti duomenų, tačiau tai, ko pakanka, lemia tikslinis objektas ir matrica. Kiekybiniam nustatymui reikia tinkamo kalibravimo ir atgavimo; tapatybei reikia duomenų, kad svarbios alternatyvos negali sukelti tų pačių stebėjimų.

Integravimo nustatymus ir pradinių duomenų apdorojimo sprendimus laikykite rezultato dalimi. Dokumentuokite laiko atskaitą, pločio susitarimą, atsako vienetus ir neišspręstas alternatyvas. Kitoje pamokoje nagrinėjama, kaip atskyrimo mechanizmai ir pernašos sąlygos pakeičia šiuos stebėjimus.

Išnagrinėti pavyzdžiai

Atimkite patikrintą nesulaikomos medžiagos atskaitą

Naudokite t_M=1.10 min ir t_R=5.50 min.

Pataisytoji sulaikymo trukmė yra 5.50−1.10=4.40 min.
k=4.40/1.10=4.00.
Neapdorotų laikų santykis yra 5.00=1+k.

Norint gauti k, reikia pašalinti bendrą pratekėjimo indėlį.

Naudokite abu liestinėmis nustatytus bazės pločius

Naudokite sulaikymo trukmes 4.80/5.40 min ir pločius 0.400/0.500 min.

Δt=0.600 min, o pločių suma yra 0.900 min.
R_s=2×0.600/0.900=1.33333.
Lygiavertė Gauso smailių pusinio aukščio forma duoda tą patį rezultatą, naudojant √(2 ln 2).

Rezultatą lemia nurodytas pločio susitarimas ir dviejų smailių vardiklis.

Vienodus plotus perskaičiuokite skirtingais atsako koeficientais

Naudokite Gauso smailę A, kuriai h=10.0 U, σ_t=0.0800 min, ir B, kuriai h=5.00 U, σ_t=0.160 min.

Abi hσ_t sandaugos yra 0.800 U·min, todėl kiekvienas visas plotas yra 2.00530262 U·min.
A plotą padalykite iš priskirto koeficiento 2.00 ir gaukite 1.00265131 mmol.
B plotą padalykite iš priskirto koeficiento 4.00 ir gaukite 0.501325655 mmol.

Plotų lygybė nėra kiekių lygybė, kai atsako koeficientai skiriasi.

Parodykite du neatskiriamus komponentų kiekių derinius

Naudokite R(t)=(2n_A+3n_B)g(t) su priskirta bendra smailės forma.

A=2.00 mmol ir B=2.00 mmol duoda koeficientą 2×2+3×2=10.0 U.
A=5.00 mmol ir B=0 duoda koeficientą 10.0 U.
Bendra g(t) kiekvienu laiko momentu daugina tą patį koeficientą.

Pagal vieną bendrą atsako formą šiame modelyje negalima atvirkštiniu būdu rasti dviejų nežinomų kiekių.

Pabandykite patys

Pagal tą patį atskaitos susitarimą t_M=1.20 min ir t_R=4.80 min. Raskite pataisytąją trukmę ir k.
Rodyti atsakymą ir paaiškinimą
3.60 min ir k=3.00.
Iš 4.80 atimkite 1.20, tada padalykite iš nesulaikomos medžiagos pratekėjimo trukmės.
Palikite 0.600 min atskyrimą laike, bet abiem liestinėmis nustatytiems bazės pločiams priskirkite 0.400 min. Raskite R_s.
Rodyti atsakymą ir paaiškinimą
R_s=1.50.
Naudokite 2×0.600/(0.400+0.400); pakeista pločių suma pakeičia skiriamąją gebą.
Pateikite vieną priežastį, kodėl du vienodi plotai pavaizduotame modelyje reiškia skirtingus kiekius, nekeisdami nė vienos smailės formos.
Rodyti atsakymą ir paaiškinimą
Kalibruoti konkretiems komponentams skirti ploto ir atsako koeficientai skiriasi.
A reikia 2.00 U·min vienam mmol, o B – 4.00 U·min vienam mmol, todėl tas pats plotas atitinka dvigubai didesnį A kiekį.
Kodėl papildomi tiksliai bendros g(t) laiko taškai neleidžia atskirti dviejų komponentų kiekių derinių esant koeliuavimui?
Rodyti atsakymą ir paaiškinimą
Kiekvienas taškas yra dar viena to paties vienintelio koeficiento 2n_A+3n_B vertė.
Naujas nepriklausomas ryšys tarp dviejų kiekių neįvedamas; reikia duomenų, kurie nuo jų priklausytų kitaip.

Ką verta įsidėmėti

Chromatograma sujungia atskyrimą ir detektoriaus atsaką.
Prieš atimdami nesulaikomos medžiagos atskaitą, ją pagrįskite.
Skiriamoji geba apima abiejų smailių pločius ir apibrėžtą susitarimą.
Aukštis, plotas ir kiekis yra skirtingi dydžiai.
Tariamai viena smailė gali likti nevienareikšmė pagal sudėtį.

Šaltiniai

Mokomoji medžiaga ir žinynai, kuriais remiasi pamokos paaiškinimai ir pavyzdžiai.